Люминесцентная, или флюоресцентная, микроскопия - метод гистологического анализа с помощью люминесцентного микроскопа, в котором используется явление люминесценции (свечения) веществ при действии на них коротковолновых лучей (ультрафиолетового света, рентгеновских лучей). Некоторые биологические соединения, присутствующие в клетках, характеризуются спонтанной флюоресценцией при попадании на клетку ультрафиолетовых лучей. Для выявления же большинства других соединений клетки обрабатываются специальными флюорохромами (флюо-ресцеином, акридином оранжевым, корифосфином). С помощью флюорохромов исследуют, например, содержание в клетках нуклеиновых кислот. При окраске акридином ДНК дает красно-зеленое свечение, а РНК - оранжевое.

Люминесцентный микроскоп широко используется также для изучения иммунофлюоресценции. Иммунофлюоресценция позволяет исследовать в клетке содержание очень малых количеств белка. Препарат предварительно обрабатывают антителами к исследуемому белку, меченными флюоресцирующим красителем.

Ультрафиолетовая микроскопия - метод изучения клеток с помощью микроскопов, в которых для освещения объекта используют ультрафиолетовые лучи (длина волны которых равна 210-275 нм). Такие микроскопы имеют большую, чем обычные световые микроскопы, разрешающую способность. Для наблюдения за объектом требуется специальная аппаратура - электронно-оптический преобразователь, который предохраняет орган зрения от действия ультрафиолетовых лучей.

Электронная микроскопия . В электронных микроскопах используют пучок электронов, длина электромагнитной волны которых в 100 000 раз короче длины волны видимого света. Разрешающая способность электронного микроскопа в сотни и тысячи раз превышает обычные оптические приборы и равна 0,5-1 нм, а современные мегавольтные электронные микроскопы дают увеличение до 1 000 000 раз. С помощью электронных микроскопов получены многочисленные данные об ультраструктуре клеток. Разновидностью электронной микроскопии является сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), при которой изучаются поверхностные структуры клеток.

Цитоспектрофотометрия - метод изучения химического состава клетки, основанный на избирательном поглощении теми или иными веществами лучей с определенной длиной волны. По интенсивности поглощения света, которая зависит от концентрации вещества, производится количественное определения его содержания в клетке.

Радиоавтография - важный информативный метод, позволяющий изучать распределение в клетках и тканях веществ, в состав которых искусственно введены радиоактивные изотопы (3Н, НС, 32Р и др.). Введенный в организм животного (или в среду культивирования клеток) изотоп включается в соответствующие структуры (например, меченый тимидин - в ядра клеток, синтезирующих ДНК). Метод основан на способности включенных в клетки изотопов восстанавливать бромистое серебро фотоэмульсии, которой покрывают срезы ткани или клетки. Образующиеся после проявления фотоэмульсии зерна серебра (треки) служат своего рода автографами, по локализации которых судят о включении в клетку примененных веществ. Применение меченных тритием предшественников нуклеиновых кислот (тимидина, аденина, цитидина, уридина) позволило выяснить многие важные аспекты синтеза ДНК, РНК и клеточных белков.

Гисто- и иммуноцитохимические методы . В их основе лежит применение химических реакций для выявления распределения химических веществ в структурах клеток, тканей и органов. Современные гистохимические методы позволяют обнаруживать аминокислоты, белки, нуклеиновые кислоты, различные виды углеводов, липидов и др. Для выявления специфических белков используют иммуноцитохимические реакции. Для этого получают специфические сыворотки, содержащие антитела (например, против белка микротрубочек - тубулина). Далее химическим путем соединяют эти антитела с флюорохромом (или другим маркером). Если меченые антитела нанести на гистологический срез, они вступают в соединение с соответствующими белками клетки и возникает специфическое свечение, видимое в люминесцентном микроскопе. Современные иммуноцитохимические методы, помимо флюорохромов, используют другие самые разнообразные специфические маркеры, позволяющие качественно и количественно оценивать содержание в клетке исследуемых соединений. Модификацией рассматриваемого метода является введение меченых антител в цитоплазму живых клеток с помощью микроманипуляторов.

Метод культуры клеток , тканей заключается в выращивании клеток и тканей вне организма в искусственных питательных средах (в условиях in vitro). Для получения изолированных клеток производят предварительную обработку материала ферментами трипсином или коллагеназой. Метод позволяет изучать реакции клеток на различные воздействия, механизмы регуляции пролиферации, дифференцировки и гибели. Особенно важное значение данный метод имеет для эмбриологических и цитофизиологических исследований, а также для трансплантации эмбриональных клеток при лечении врожденных и приобретенных дефектов обмена веществ.

Микроскопическая хирургия клетки - совокупность методических приемов, осуществляемых с помощью специального прибора - микроманипулятора. Этот прибор позволяет производить различного рода тончайшие операции на клетке (введение веществ, удаление или пересадка структурных компонентов клетки, нанесение уколов, разрезов и пр.) и нашел широкое применение в эмбриологии.

Цейтрафферная, или замедленная , микрокино- или видеосъемка - изучение живых клеток. Такой способ позволяет проследить за медленно протекающими изменениями клеток.

Метод фракционирования (дифференциального центрифугирования) клеток. Его суть заключается в получении из клеток изолированных структурных компонентов. Основан на разных скоростях осаждения этих компонентов при вращении гомогенатов клеток в ультрацентрифугах. Данный метод сыграл и играет очень важную роль в изучении химического состава и функциональных свойств субклеточных элементов - прежде всего, органелл.

Конфокальная микроскопия - современный метод, использующий в качестве осветителя лазерный луч, который последовательно сканирует всю толщину препарата. Информация о плотности объекта по каждой линии сканирования передается в компьютер, где специальная программа осуществляет трехмерную реконструкцию исследуемого объекта.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) является методом оптического трехмерного (3D) поверхностного профилирования с высокой разрешающей способностью.

Высокая числовая апертура линзовых объективов (до 0.95) и короткая длина волны лазерного излучения обеспечивают получение изображений с высоким разрешением вдоль оптического и поперечного направлений.

Также конфокальные микроскопы обладают значительным контрастом по сравнению с классическими оптическими микроскопами за счет использования специальной диафрагмы (пинхол), отсекающей поток фонового рассеянного света - это помогает улучшить качество изображения.

В конфокальном микроскопе в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценное изображение строится путем сканирования (движение образца или перестройка оптической системы). Для того чтобы регистрировать свет только от одной точки после объектива располагается пинхол таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой, проходит через него и будет зарегистрирован, а свет от остальных точек отрезается данным пинхолом.

Повышение контраста изображения также достигается за счет того, что осветитель создает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в анализируемую точку. Это может достигаться за счет использования светоделительной пластинки, так чтобы и падающий и отраженный свет фокусировались одним объективом. Такая схема к тому же облегчает юстировку.

Получение изображения в режиме реального времени достигается за счет модуля быстрого сканирования и алгоритма обработки сигналов. Для получения 3D профиля поверхности образца требуется менее 1 секунды. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия является техникой оптического неразрушающего контроля для профилирования поверхностей микроструктур с высоким разрешением. Это является идеальным решением для измерения и проверки полупроводниковых пластин, FPD продуктов, MEMS устройств, поверхностей стекла и других материалов.

Способность измерения высоты достигается благодаря конфокальному расположению источника, образца и детектора. Когда образец находится в фокальной плоскости объектива, свет, отраженный на поверхности образца, фокусируется на конфокальное отверстие, а фотодетектор собирает сигнал от образца. Однако образец помещают в положение не в фокусе, и световой сигнал отклоняется конфокальной диафрагмой. Таким образом, только сигнал в фокусе попадает на фотодетектор. Этим объясняется оптическая селективная способность CLSM технологии.

Для получения 3D профиля поверхности образца, оптические изображения собираются вдоль оси Z. Благодаря конфокальному отверстию интенсивность света максимальна, когда образец располагается в фокальной плоскости.

Максимальная интенсивность излучения регистрируется в фокальной плоскости. Интенсивность уменьшается, когда образец отводится от фокальной плоскости.

Для точного нахождения максимальной интенсивности используется многоточечное позиционирование вблизи максимального положения. Это обеспечивает максимальную воспроизводимость измерения высоты. Высота рассчитывается путем аппроксимации кривой на каждом пикселе. С помощью этой высотной карты строится профиль поверхности образца.

Как уже говорилось выше, важными параметрами данной технологии являются высокое разрешение и высокий контраст. В наших конфокальных микроскопах (серии NS-3500) эти параметры улучшены за счет использования пьезоэлектрических приводов для перемещения сканирующей головки в диапазонах 200 мкм и 400 мкм с шагом в 0.1 нм в режиме точного сканирования, что позволяет получать изображения поверхности образцов с еще более высоким разрешением и контрастом, чем у других конфокальных микроскопов. Данная особенность позволяет анализировать и получать трехмерные изображения мельчайших структур, исследовать до нескольких слоев прозрачных покрытий на различных микросхемах, проводить анализ микроглубоких структур (например, анализ микро- и нанотрещин нефтяных и газовых труб, поршней двигателей автомобилей, закрылок самолетов и т.п.).

Другим важным аспектом для конфокальной микроскопии является необходимость наличия инструмента для анализа полученной информации. Наше простое и интуитивное программное обеспечение позволяет с легкостью анализировать полученные изображения с цифровым разрешением до 0.001 мкм. Также оно предоставляет Вам возможность анализировать большие образцы за счет сканирования малых областей и их последующего сшивания, проводить анализ шероховатости и отдельных пирамидальных и конусообразных микроструктур (что особенно важно при контроле солнечных элементов) и т.п. Дополнительная система автофокусировки и наличие ПЗС-камеры еще больше упрощают процедуру измерения и позволяют Вам полностью сосредоточиться на исследовании, не отвлекаясь на второстепенные действия.

CLSM имеет множество применений в промышленных областях, поскольку это быстрый, неразрушающий и надежный способ 3D профилирования поверхностей. Лазерный конфокальный микроскоп может измерять 3D форму, высоту ступеньки, объем микроструктур, ЖК панели, полупроводниковые пластины, MEMS устройства, поверхности материалов, прозрачные стеклянные поверхности. Кроме того, конфокальная микроскопия широко используется для биологических исследований.

ООО «Мелитэк» поставляет лазерные конфокальные микроскопы. Это современное исследовательское оборудование, которое значительно отличается по своим возможностям от обычных световых микроскопов. С его помощью можно получить не только двухмерные, но и трехмерные изображения, получить информацию о профиле поверхности, измерить толщину полупрозрачных покрытий и пр.

Лазерный конфокальный микроскоп находит свое применение в качестве инструментального микроскопа для измерения линейных размеров, углов, радиусов и пр. Благодаря точности измерения такие микроскопы подходят для контроля качества измерительных, металлообрабатывающих и медицинских инструментов, микроэлектронных компонентов и иных деталей, контроль которых подразумевает проведение измерений в плоскостях XY, XZ и YZ, Одной из особенностей микроскопа LEXT OLS5000 является возможность построения моделей и проведения измерений поверхностий с углом наклона до 87.5 0

Лазерный микроскоп дает возможность изучать структуру и топографию поверхности с возможностью определения перепадов высоты до 6 нм у прозрачных и непрозрачных образцов, что обуславливает его широкое применение в материаловедении, криминалистике и микроэлектронике. Благодаря лазерному источнику света с длиной волны 405 нм подсветке, конфокальной оптической схеме, а так же применении. ФЭУ вместо обычных CMOS или CCD детекторов микросоп LEXT OLS5000 обладает очень малой глубиной резкости, что позволяет определять высоту фокальной плоскости и строить высокоточные 3D модели поверхности. Специальное программное обеспечение позволяет проводить измерение профиля, площади и объема полученных моделей. В плоскости разреза модели можно проводить измерение линейных размеров, радиусов окружностей и углов. Изображения и модели сохраняются в специальном формате, который позволяет провести дополнительные измерения при необходимости.

Характерные особенности, нового конфокального микроскопа LEXT OLS5000:

• определение перепада высот 6 нм
• латеральное разрешение 120 нм
• гарантированная точность измерения линейных размеров на изображениях, полученных методом панорамной сшивки;
• высокая скорость сканирования благодаря специальным алгоритмам;
• повышенная контрастность за счет двойной конфокальной схемы
• цветные изображения с разрешением 4К;
• возможность работать с образцами различных размеров и формы
• инновационные алгоритмы подавления шумов при сканировании.

Специальная модель рамы позволяет проводить измерения образцов высотой до 210 мм, а новые объективы, скорректированные для работы с лазером 405 нм с увеличенной рабочей дистанцией, позволяют исследовать поверхности в углублениях до 25 ммОписания и технические характеристики микроскопов для измерения линейных размеров, представленных в каталоге ООО «Мелитэк», вы найдете на нашем сайте. Если у вас есть вопросы, на них готовы ответить наши сотрудники.

В настоящей главе будут рассмотрены основные принцы, устройство, применение конфокального лазерного сканирующего микроскопа (КЛСМ) на примере приборов фирмы Leica. Принцип КЛСМ – регистрация светового потока, исходящего из фокальной плоскости объектива при совпадении фокусов, т. е. диафрагма детектора должна быть позиционирована так, чтобы ее изображение точно совпало с фокусом освещающего объект света. В качестве источника освещения применяются лазеры и чувствительные детекторы для получения изображения.

Основная особенность КЛСМ состоит в возможности получения послойного изображения исследуемого объекта (например, клетки) с высоким разрешением и с низким уровнем шумов. Достигается это путем пошагового сканирования объекта сфокусированным пучком света от когерентного источника или столиком, использованием специфических флуоресцентных зондов и специальных методов ограничения световых потоков.

Системы сканирования в КЛСМ можно классифицировать следующим образом.

1. Сканирование лучом.

А) Зеркальные системы: однозеркальные, двухзеркальные, резонансные магнитоэлектрические.

Б) Световолоконные системы: одноволоконные, многоволоконные.

В) Сканирование объективом:

· пьезоэлектрическое перемещение объектива по осям Х, Y;

· пьезоэлектрическое перемещение объектива по оси Z.

Г) Акустооптические дефлекторы луча: два акустооптических дефлектора для сканирования по осям Х и Y.

Д) Дисковые системы:

· односпиральные односторонние и двухсторонние;

· многоспиральные односторонние и двухсторонние.

Е) Комбинированные системы: акустооптический дефлектор по оси Yи сканирование зеркалом по оси Х.

2. Сканирование столиком.

А) Шаговый привод: сканирующий столик с шаговыми двигателями по осям Х, Y, Z.

Б) Комбинированный привод: сканирующий столик с шаговым двигателем по осям X, Yи пьезоэлектрический привод по оси Z.

Рис. 5. Принципиальная схема работы КЛСМ.

1 - сканирующий столик; 2 - исследуемый образец; 3, 7 - объективы; 4 - сканирующее устройство; 5 - светоделительная пластина; 6 - луч света от лазера; 8, 12 - изображение точек В и С; 9 - игольчатая диафрагма; 10 - изображение точки А в центре игольчатой диафрагмы; 11 - приемник излучения; 13, 15 - свечение точек В и С, находящихся вне фокуса объектива 3; 14 - свечение точки А, находящейся в фокусе объектива 3.

Световой поток возбуждения 6 от лазерного источника поступает через светоделительную пластину 5, сканирующую систему 4 на объектив 3 и фокусируется в точку А плоскости исследуемого препарата (например, клетки), находящейся в фокусе. Полагаем, что внутриклеточные структуры связаны с флуоресцентными зондами и точку А фокусировки пучка можно рассматривать как точечный источник света, поток флуоресценции от которого через объектив 3, светоделительную пластину 5, объектив 7 фокусируется в плоскости игольчатой диафрагмы 9 ("pinhole") и регистрируется фотодетектором 11. Освещенность потоком возбуждения фрагментов препарата, лежащих вне фокуса объектива вдоль оптической оси (точки В и С), ниже, чем в точке А. Следовательно, составляющая освещенности мишени детектора от точек В и С может быть существенно уменьшена. Потоки флуоресценции, исходящие от точек В и С, лежащих вне фокуса, ограничиваются точечной диафрагмой и на детектор не попадают, либо попадает их малая часть. Таким образом, при сканировании препарата в плоскости XY детектором регистрируется сигнал, уровень которого определяется расстоянием от плоскости сканирования вдоль координаты Z. Совмещение фокуса объектива 3 с плоскостью сканирования и фокуса объектива 7 с игольчатой диафрагмой отражено в термине "конфокальность". Пошаговое перемещение плоскости сканирования вдоль оси Z позволяет получить серию контрастных послойных изображений и реконструировать внутреннюю трехмерную структуру (3-D) исследуемого объекта. Качество изображения, разрешение в плоскости XY и вдоль оси Z зависит от качества оптики, качества сканирующих систем, размеров и точности изготовления точечной диафрагмы, жесткости конструкции, эффективности используемых алгоритмов обработки сигналов, специфичности флуоресцентных зондов.

Для определения пространственной разрешающей способности микроскопа проводят анализ изображения точечного источника света. Изображение точечного источника, формируемое обычной линзой, представляет собой дифракционное пятно Эри, состоящее из яркого центрального ядра и более слабых внешних колец.

Рис. 6. Дифракционное пятно Эри.

Два точечных источника одинаковой яркости, расстояние между которыми равно d, видны как две различные точки, если расстояние между центрами кружков Эри превышает следующее значение:

r A = XY =0,6 λ/NA,

где r A - радиус первого темного кольца в кружке Эри, λ- длинна волны источника света в нм, NA – числовая апертура.

Это выражение называют критерием Рэлея. Оно определяет разрешающую способность микроскопа в плоскости образца (XY). При этом предел разрешения определяется прежде всего волновой природой света, и поэтому его часто упрощают, считая NA=1. В КЛСМ формирования изображения приводит к небольшому уменьшению размера пятна Эри. Интенсивность пятна Эри для стандартного микроскопа уменьшается по закону n -2 ,где n - поперечное смещение, а для КЛСМ интенсивность уменьшается как n -4 . Это приводит к увеличению разрешающей способности КЛСМ в 1,5 раза. Для конфокального микроскопа критерий Рэлея имеет вид:

XY c r =0,4 λ/NA,

где XY c r – разрешающая способность КЛСМ.

Для оценки преимущества КЛСМ, рассмотрим аппаратную функцию (структуру пятна Эри) и проанализируем разрешающую способность микроскопа в осевом направлении (Z). Трехмерное пятно Эри (распределение интенсивности), является трехмерной аппаратной функцией (ТАФ) которая определяет изображение объекта. ТАФ для обычного микроскопа имеет коническую форму, расширяющуюся вверх и вниз от центра, тогда как для конфокального микроскопа она имеет эллиптическую форму и менее вытянута в осевом направлении.

Рис. 7. Вид трехмерной аппаратной функции точечного источника обычного микроскопа – (а) и КЛСМ – (б).

Критерий Рэлея применим и для определения разрешающей способности микроскопа в направлении оптической оси. Для обычного микроскопа два точечных источника, расположенные на некотором расстоянии вдоль оптической оси, можно разрешить, если максимумы их пятен Эри находятся на расстоянии:

Z r =2 λ/NA 2 ,

где Z r - осевая разрешающая способность микроскопа.

Распределение энергии в пятне Эри для КЛСМ более узкое, и разрешающая способность в осевом направлении в 1,4 раза выше. Для конфокального микроскопа критерий Рэлея имеет вид:

Z r c =1,4 λ/NA 2 ,

где Z r c - осевая разрешающая способность КЛСМ.

Современные КЛСМ имеют одно главное преимущество - возможность получения тонких оптических срезов. На качество изображения при получении тонких оптических срезов влияют следующие параметры:

· размер конфокальной диафрагмы;

· числовая апертура объектива NA;

· показатель преломления;

· поглощение света в образце.

Уменьшение интенсивности света по мере увеличения толщины образца влияет на разрешение микроскопа по оптической оси Z. Разрешение зависит от оптики микроскопа и образца. Толщину оптического сечения в конфокальном микроскопе обычно характеризуют шириной распределения на полувысоте пика интенсивности ∆z 1/2 = 0,65мкм. Если образец и детектор идеальны, этот параметр зависит от числовой апертуры объектива, длины волны λ и показателя преломления иммерсионной среды n i .

Рис. 8. Зависимость осевой разрешающей способности микроскопа ∆z 1/2 от числовой апертуры объектива.

В КЛСМ перед детектором ставится регулируемая диафрагма, изменяющая количество света. Игольчатые диафрагмы предназначены для создания условий максимальной или полной фильтрации света, попадающего в плоскость формирования изображения от точек, не совпадающих с фокальной плоскостью или находящихся рядом с анализируемым элементом объекта в фокальной плоскости. Размер игольчатой диафрагмы конечен, и от него зависят поперечное разрешение прибора, яркость освещенных элементов препарата, смещенных относительно фокальной плоскости по оси Z, и глубина резкости. Размер диафрагмы влияет на толщину получаемого сечения. Чем меньше диафрагма, тем ближе толщина сечения к теоретическому пределу (шириной распределения на полувысоте пика интенсивности), а при очень больших апертурах способность получать тонкое сечение становится невозможным.

Как говорилось ранее, КЛСМ дает возможность получать оптическое сечение на значительной глубине от поверхности образца, при этом важным моментом является показатель преломления и проблема глубины. Прохождение падающего и отраженного луча через образец влияет на качество изображения. Если показатели преломления иммерсионной среды и образца близки (влияние разности показателей преломления иммерсионной жидкости и объекта на появление рассеянного света, снижающего контраст изображения и действующего как эффект сферической аберрации), световой конус будет сходиться. Если же показатели преломления различаются, появляется сферическая аберрация.

Рис. 9. Показатели преломления иммерсионной среды и образца.

а – формирование изображения иммерсионным объективом без аберрации; б – сферическая аберрация, обусловленная несоответствием показателей.

При разных показателях преломления световые лучи, идущие на различном расстоянии от оптической оси, в одну точку не фокусируется, что приводит к потере качества изображения. По возможности показатели преломления образца и объектива должны быть согласованы. Если показатели преломления образца и иммерсионной среды различаются, изображение объекта на глубине размыто вдоль оптической оси, а плоскость фокуса сдвинута. Для увеличения глубины проникновения объектив должен иметь большую числовую апертуру, например иммерсионный объектив. Однако такие объективы имеют малое максимальное расстояние от линзы объектива до фокальной плоскости. На глубину проникновения влияет неоднородность образца, которая приводит к снижению интенсивности света на большой глубине и появлению тени. В идеале образец, позволяющий достичь максимальной глубины проникновения и максимального разрешения, должен иметь показатель преломления, равный показателю преломления объектива, но это однородный образец, а таких биологических образцов не существует.

Во время сканирования КЛСМ получает ряд оптических сечений с регулярно возрастающей глубиной от поверхности образца. Для большинства КЛСМ получение сотни 2D-изображений занимает всего несколько минут. Оптическое изображение можно получить двумя способами:

1) получение последовательности оптических сечений в плоскости XY, расположенных на расстоянии ∆z друг от друга. Сопоставление координат центров объектов в различных сечениях дает возможность определить их ориентацию и распределение по длине.

Рис. 10. Изучение трехмерной структуры в плоскости XY.

2) получение ряда оптических сечений в плоскости XZ, расположенных на расстоянии ∆y. Если образец параллелен плоскости сечения, то его сечение в плоскости XZ будет почти круглым, при сопоставлении изображений в различных XZ сечениях, можно определить изогнутость исследуемого объекта.

Рис. 11. Изучение трехмерной структуры в плоскости XZ.

Трехмерная реконструкция исследуемых объектов методами КЛСМ направлена на решение двух задач:

· визуализации объемного изображения объекта, полученного путем "сборки" его оптических срезов;

· количественного анализа внутренних структур объекта.

На сегодняшний день существует достаточно много фирм производителей КЛСМ. Инновации фирм-производителей КЛСМ:

· 2002 г. фирма Leica анонсировала акустооптический светоделитель (AOBS), позволяющий эффективно разделять лазерный луч возбуждения и люминесценцию;

· 2002 г. фирма Carl Zeiss начала выпускать конфокальный микроскоп LSM 510 META с оригинальным фотоприемником, регистрирующим сигнал одновременно в 32-х спектральных каналах;

· 2004 г. Zeiss создает высокоскоростной LSM 5 Live, имеющий скорость сканирования в 20 раз выше обычного КЛСМ;

· Фирма Olympus разработала прибор с двумя сканерами, позволяющий более эффективно применять, например, методику FRAP;

· Nikon - создает компактный и недорогой КЛСМ упрощенной конструкции;

· 2007 год фимра Leica объявила о выпуске 4Pi-конфокального микроскоп, улучшающий аксиальное разрешение в 4 - 7 раз.

Рассмотрим устройство КЛСМ относящегося к новому более совершенному поколению приборов – TCS SP5 фирмы Leica.

Рис. 12. Многофотонная/конфокальная широкополосная система TCS SP5 (инвертированный микроскоп).

Ключевые элементы КЛСМ TCS SP5: AOTF – акустико-оптический настраиваемый фильтр, AOBS – акусто-оптический светоделитель, SP-Detector – датчик спектрального фотометра.

AOTF – акустико-оптический настраиваемый фильтр – служит для минимизации оптического экспонирования, настраивает мощность лазера в зависимости от образца и флуорохрома. Позволяет выбрать необходимую длину волны и управлять интенсивностью света возбуждения. AOTF - представляет собой электрически перестраиваемый фильтр, работающий на принципе объемной дифракции светового пучка на неоднородностях показателя преломления. Такие неоднородности возникают при возбуждении в двулучепреломляющих кристаллах ультразвуковой акустической волны. При анизотропной дифракции в одноосных кристаллах существует минимальная частота ультразвука, при которой углы падения и дифракции совпадают, и происходит так называемое коллинеарное акустооптическое взаимодействие.

Рис. 13. Акустико-оптический настраиваемый фильтр.

AOBS – акусто - оптический светоделитель, это акусто-оптический кристалл – настраиваемое преломляющее устройство, работающее в реверсивном режиме. Что дает использование AOBS:

1. Для получения четкого, с низким уровнем шума, изображения необходима высокая степень светопропускания. Уменьшение же шума за счет усреднения изображения по многим последовательным сканированиям с необходимостью приводит к фотообесцвечиванию изучаемого объекта. Степень светопропускания AOBS превосходит большинство дихроичных зеркал во всем видимом диапазоне спектра. Следовательно, требуется усреднение по меньшему числу сканирования. В результате препарат просуществует гораздо дольше;

2. Яркие и четкие изображения требуют прохождения как можно большего числа фотонов от объекта к детектору, что улучшает качество изображения. AOBS обеспечивает регистрацию максимально широких полос флуоресценции, то есть максимального числа фотонов;

3. Низкое обесцвечивание во время получения изображения важно для защиты образца от выцветания, а живых объектов от токсичных продуктов фотолиза флуорохромов. Кривые светопропускания AOBS имеют очень крутые наклоны, что позволяет регистрировать флуоресценцию флуорохрома максимально близко к полосе его возбуждения;

4. Может быть возбужден любой краситель видимого диапазона, так как отражение может настраиваться индивидуально;

5. Решен вопрос многопараметрической флуоресценции: можно запрограммировать до восьми линий излучения лазера, оставляя достаточно места для регистрации флуоресценции, при этом частоты настраиваются;

6. Соотношение красителей, как соотношение возбуждения метаболит - проб, например, для Са 2+ , мембранного потенциала, водородного показателя должно быстро переключаться при последовательном сканировании. AOBS переключается за несколько микросекунд;

7. Регистрация изображения в отраженном свете - еще одна возможность использования. AOBS позволяет настраивать прохождение отраженного возбуждающего света индивидуально;

8. Сканирование ROI (последовательное сканирование и сканирование определенной зоны) также улучшено: различные режимы возбуждения применимы для различных областей во время отдельного сканирования;

9. Большой объем 3D записей, в последовательном режиме выигрывает от устройств с быстрым переключением, так как скорость увеличивает эффективность системы;

10. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) требует низкого фона и малого светорассеяния Только AOBS эффективно блокирует близкие линии излучения, например, от Аr лазеров;

11. Спектральная запись (Лямбда сканирование) обеспечивает точный спектр, так как светопропускание AOBS «белое», а это значит, что он не вносит изменений в спектр испускания - что является обычной проблемой при выполнении спектрального сканирования в системе с дихроичными зеркалами;

12. Для истинного конфокального получения оптических срезов необходимо точечное освещение и точечная регистрация флуоресценции. AOBS подходит для работы с конфокальными устройствами точечного сканирования;

13. Получение изображения в мультифотонном режиме либо при ультрафиолетовом возбуждении может быть выполнено параллельно без ошибок или ограничений. AOBS не меняет возбуждение лазеров невидимого диапазона и не меняет спектр флуоресценции;

14. Невозможно выполнить ошибочную операцию, так как AOBS контролируется совместно с управлением возбуждения при помощи AOTF (акустико-оптический настраиваемый фильтр). Если выбрана линия возбуждения, то и AOBS запрограммирован в соответствии с ней. Оператору не надо принимать решения - работа выполняется правильно и автоматически;

15. Отсутствует разюстировка, так как нет подвижных элементов присущих фильтровым барабанам и слайдерам. Кристалл прочно установлен, программирование выполняется электронным способом;

16. Нет необходимости в дорогостоящем дополнительном оборудовании, например, фильтровых кубиков, слайдеров дихроичных зеркал и т.д. Поэтому гораздо меньше расходы на техническую помощь для установки новых оптических элементов.

Рис. 14. AOBS – акусто - оптический светоделитель.

SP-Detector – датчик спектрального фотометра. Свет от образца, являющийся суммой спектров вызванной флуоресценции проходит pinhole диафрагму, которая формирует конфокальный оптический срез. Далее при помощи призмы этот свет раскладывается в спектр. При прохождении первого детектора, свет проходит устройство щелевого фотометра, состоящего из двух шторок с приводом. Эти шторки обрезают края спектра с обеих сторон диапазона и направляют к сенсорам 2 и 3 порядка. В итоге спектр раскладывается одновременно на пять каналов. В итоге при использовании SP – детектора регистрируется излучение от различных красителей в образце.

Рис. 15. Спектральный детектор SP.

SP – детектор позволяет производить лямбда-сканирование: спектральные изображения накапливаются для анализа характеристик красителей, задействованных в эксперименте, сразу.

Марголин 389с.

Оптическая микроскопия использовала все достижения как техники и технологии, так и информационных и компьютерных технологий. Это привело к значительному усовершенствованию имеющейся аппаратуры и методик ее использования, что, в свою очередь, привело к появлению новых методов, в частности, кон­фокальной микроскопии. Конфокальный микроскоп отличается от классического оптического микроскопа тем, что в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объек­та, а полноценное изображение строится путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы). Та­ким образом, в своеобразной форме реализуется принцип рас­тровой электронной микроскопии, что позволяет сколь угодно долго регистрировать и обрабатывать сигнал с каждой отдельно взятой точки.

В классическом микроскопе в фотоприемное устройство попа­дает свет из различных точек образца. В конфокальном микроско­пе для того, чтобы регистрировать свет только от одной точки, после объективной линзы располагается диафрагма малого разме­ра таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой, проходит через диафрагму и будет зарегистрирован, а свет от ос­тальных точек в основном задерживается диафрагмой, как это показано на рис. 7.28.

Рис. 7.28. Схема прохождения лучей в конфокальном оптическом микроскопе

Еще одна особенность заключается в том, что осветитель со­здает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в анализируемую точку. Это может достигаться расположени­ем второй фокусирующей системы за образцом, но при этом тре­буется, чтобы образец был прозрачным. Кроме того, объективные линзы обычно имеют высокую стоимость, поэтому использова­ние второй фокусирующей системы для подсветки мало предпоч­тительно. Альтернативой является использование светоделитель­ной пластинки, так чтобы и падающий и отраженный свет фоку­сировались одним объективом. Такая схема к тому же облегчает юстировку.

Рассмотрим теперь, каким образом и насколько количествен­но изменяется контрастность при применении конфокальной микроскопии. Так как в конфокальном микроскопе свет дважды проходит через объектив, функция размытия точки (далее обо­значаемая PSF) будет представлять собой произведение независи­мых вероятностей того, что фотон попадет в точку с ее координа­тами либо фотон будет зарегистрирован из этой точки.

Если использовать критерий Рэлея для разрешения, то полу­чится, что разрешение в конфокальном микроскопе увеличивает­ся, но не существенно. Для конфокального микроскопа имеем выражение для разрешения r:

В то время как для обычного микроскопа:

Однако основным достоинством конфокального микроскопа является не увеличение разрешения в смысле критерия Рэлея, а существенное увеличение контрастности. В частности, для обыч­ной PSF в фокальной плоскости отношение амплитуды в первом боковом максимуме к амплитуде в центре составляет 2%, а для конфокального микроскопа это отношение будет составлять 0,04 %. Из этого следует, что тусклый объект с интенсивностью, напри­мер, в 200 раз меньшей, чем у яркого объекта, в обычном микро­скопе обнаружить невозможно, хотя расстояние между объектами может быть существенно больше того расстояния, которое пред­писано критерием Рэлея. В то же время в конфокальном микро­скопе такой объект должен хорошо регистрироваться.

Важным параметром является размер диафрагм в фокальной плоскости облучающей и собирающей линз. Изображение диаф­рагмы в плоскости объекта определяет, из каких областей свет регистрируется фотодетектором. Очевидно, что уменьшение раз­мера диафрагмы приводит к уменьшению количества проходяще­го света, увеличивает уровень шума и в конечном итоге может свести на «нет» все достигнутые преимущества по контрастности. Таким образом, встает вопрос об оптимальном выборе размера диафрагмы и разумном компромиссе.

Диафрагма с размером отверстия меньше пятна Эйри просто приводит к потере интенсивности и никак не влияет на разреше­ние. Диафрагма с размером отверстия в одно пятно Эйри позво­ляет максимально использовать разрешающую способность объек­тивной линзы. Однако диафрагма с размером отверстия примерно в 3 - 5 раз больше пятна Эйри представляется наиболее подходя­щим компромиссом. Следует понимать, что обсуждаемый здесь размер имеет смысл размера изображения в плоскости объекта, а поэтому реальный размер отверстия в диафрагме зависит от уве­личения линзы. В частности, при использовании 100-кратной линзы диафрагма с отверстием 1 мм будет спроецирована в плоскость объекта в круг радиусом 10 мкм.

Развитием идеи конфокальной микроскопии явилась разработка конфокального лазерного сканирующего микроскопа (KJICM), что было вызвано потребностью в более чувствительных и метрологи­чески строгих методах анализа формы и пространственной струк­туры наблюдаемых объектов. Принципиальная схема КЛСМ с ос­новными функциональными связями показана на рис. 7.29.

Основной особенностью КЛСМ является возможность послой­ного изображения исследуемого объекта с высоким разрешением и низким уровнем шумов. Достигается это путем пошагового ска­нирования объекта сфокусированным пучком света от когерент­ного источника или передвижением столика с использованием специальных флуоресцентных зондов и специальных методов ог­раничения световых потоков.

Рис. 7.29. Структурная схема KJICM:

1 - сканирующий столик; 2 - исследуемый образец; 3, 6 - объективы; 4 - сканирующее устройство; 5 - светоделительная пластина; 7, 9 - игольчатые ди­афрагмы; 8 - приемник излучения; 10 - лазер; 11 - блок управления; 12 - компьютер; 13 - привод для сканирования по оси z.

Использование в КЛСМ точечной диафрагмы, размеры кото­рой согласованы с увеличением микроскопа и длиной волны, дает возможность повысить разрешение более чем на 10%. Очевидно, что разрешение КЛСМ и соответственно возможности анализа тон­ких структур могут превышать аналогичные возможности обычного микроскопа не более чем на 40 % в условиях сканирования пре­парата тонким лучом. Разрешающая способность KЛCM зависит от способа микроскопирования и освещения. Разрешение KЛCM оп­ределяется как оптической системой, так и электронным трактом обработки информации. Поэтому в конструкции KЛCM, его схе­мах должны быть согласованы такие параметры, как разрешение оптической системы, шаг сканирования, характеристики детекто­ра, а также должны быть выбраны оптимальные алгоритмы обра­ботки и соответствующее программное обеспечение.

В общем случае глубина резкости KЛCM зависит от апертуры, длины волны, когерентности источников света и размеров иголь­чатой диафрагмы. Игольчатая диафрагма является основным эле­ментом конструкции, отличающим KЛCM от других типов мик­роскопов. Игольчатые диафрагмы предназначены для создания условий максимальной или полной фильтрации света, попадаю­щего в плоскость формирования изображения от точек, не совпа­дающих с фокальной плоскостью или находящихся рядом с анализируемым элементом объекта в фокальной плоскости.

Выбор оптимального диаметра игольчатой диафрагмы важен для получения требуемых характеристик прибора. Соотношения для оценки латерального разрешения и глубины резкости KJICM получаются в предположении, что игольчатая диафрагма имеет малое отверстие, являясь светящейся точкой. Реально размер иголь­чатой диафрагмы конечен и от него зависят поперечное разреше­ние прибора, яркость освещенных элементов препарата, смещен­ных относительно фокальной плоскости по оси z, и глубина рез­кости. При малых диаметрах игольчатой диафрагмы све­товой поток становится малым, что уменьшает отношение сиг­нал/шум и снижает контрастность. При больших диаметрах эф­фективность игольчатой диафрагмы снижается за счет уменьше­ния апертуры.