Размножение днк вирусов. Вирусы, строение и размножение вирусов
Размножение вирусов Размножение вирусов
процесс образования новой генерации вирусов, подобной исходной. Протекает многовариантно в живых метаболически активных клетках животных, растений, бактерий, являющихся хозяевами этого вида вируса. В общих чертах состоит из: 1) прикрепления вириона к рецепторам мембран хозяина; 2) проникновения вириона или вирусного генома в клетку-хозяина; 3) освобождения генома от оболочек; 4) торможения активности генома хозяина; 5) множественной репликации вирусного генома; 6) наработки пула структурных белков вируса; 7) сборки вирионов; 8) выхода дочерних вирионов из клетки-хозяина. При острой продуктивной инфекции клетка-хозяин погибает при выходе вирионов, при хронической - может жить и даже выполнять присущие ей функции более или менее длительное время (в зависимости от множественной инфекции).См. Вирусные инфекции , Абортивная инфекция, Интегральная инфекция.
(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)
Смотреть что такое "Размножение вирусов" в других словарях:
См. Размножение вирусов. (Источник: «Словарь терминов микробиологии») … Словарь микробиологии
Эта статья предлагается к удалению. Пояснение причин и соответствующее обсуждение вы можете найти на странице Википедия:К удалению/9 августа 2012. Пока процесс обсуждени … Википедия
- «Война вирусов» игра, которая имитирует развитие двух колоний вирусов, которые развиваются сами и уничтожают друг друга. Точное происхождение её неизвестно, можно лишь сказать, что она появилась в 80 х годах XX века в Ленинградском университете … Википедия
Микроклональное размножение растений один из способов вегетативного размножения в условиях «in vitro» Содержание 1 Общая информация 2 Этапы и методы клонального микро … Википедия
- (от лат. virus яд), неклеточные формы жизни, способные проникать в определённые живые клетки и размножаться только внутри этих клеток. Подобно всем др. организмам В. обладают собств. генетич. аппаратом, к рый кодирует синтез вирусных частиц из… … Биологический энциклопедический словарь
Запрос «Вирус» перенаправляется сюда; см. также другие значения. Вирусы … Википедия
Запрос «Вирус» перенаправляется сюда. Cм. также другие значения. ? Вирусы Ротавирус Научная классификация Надцарство … Википедия
Запрос «Вирус» перенаправляется сюда. Cм. также другие значения. ? Вирусы Ротавирус Научная классификация Надцарство … Википедия
«Ну вот опять подцепил вирус!» Так, пристально всматриваясь в шкалу горячего градусника, родители сообщают нам о существовании этих загадочных мелких пакостников. Помимо досады, в голосе взрослых читаются тревожные нотки. Наверно, не всякий родитель знает, что слово «вирус» с латыни переводится как «яд», но все точно слышали о великих эпидемиях прошлого и смертельных угрозах, таящихся в современных мегаполисах, - о гриппе, гепатите, СПИДе... Так что же это за существа или вещества такие - вирусы? И все ли они так страшны?
Вообще, вирусы прекрасны. Они прекрасно выглядят и прекрасно приспособлены к использованию в своих целях любых живых организмов: животных, растений, грибов, простейших, бактерий и архей. И даже неклеточных созданий, братьев-вирусов.
Как вирусы устроены?
В простейшем случае вирус состоит из генома (одно- или двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты) и белковой оболочки. Если оболочки нет, то объект не дотягивает до звания вируса и довольствуется именем вироид . Нуклеиновая кислота - ДНК или РНК - кодирует необходимые для размножения вируса белки. У одних вирусов геном содержит инструкции для построения всего парочки белков, у других - двух тысяч и более. Белковая оболочка, или капсид , защищает нуклеиновую кислоту от повреждений и состоит из нескольких повторяющихся деталей - капсомеров , которые, в свою очередь, построены из молекул одного или нескольких типов белка. Капсид может иметь форму икосаэдра (двадцатигранника, но не всегда правильного), нити или палочки, а может сочетать разные формы: например, у большинства вирусов бактерий - бактериофагов - икосаэдрическая «головка» насажена, как эскимо, на палочковидный полый отросток .
Но далеко не все вирусы устроены так просто: некоторые покрываются сверху дополнительной, сворованной у хозяина и слегка измененной липидной мембраной , нашпигованной хозяйскими и вирусными белками - они очень полезны для инфицирования новых клеток. Так делают, например, вирусы гриппа и иммунодефицита человека (ВИЧ). Совсем сложные вирусы, например, вирус осповакцины или мимивирус, могут похвастать многослойной «одеждой». Они способны перетаскивать в своих частицах много полезных молекул - ферментов и факторов, необходимых для построения новых вирионов. Большинство же вирусов вынуждено полагаться только на хозяйскую систему синтеза белка.
Как вирусы размножаются?
Если живая клетка размножается делением, то вирус многократно копирует свои «запчасти» в пораженной клетке. Любая клетка любого организма ему не подходит - нужна особенная, которую вирус узнает по специальным молекулам на клеточной поверхности, рецепторам . Поэтому человеку не страшны многие вирусы других млекопитающих, а ВИЧ может начать свою подрывную деятельность только после контакта с конкретными клетками иммунной системы. Когда долгожданная встреча происходит, вирус проникает в клетку через повреждения (так любят делать вирусы растений) либо путем слияния своей внешней оболочки с клеточной мембраной, а может впрыскивать, как шприцем, свой геном через клеточную стенку (так поступает большинство бактериофагов) либо заглатываться самόй клеткой, не заметившей подвоха.
В клетке вирус полностью или частично «раздевается». Если геном вируса представлен ДНК, то процесс его копирования, или репликации , происходит в клеточном ядре. Большинство вирусов уже с этого этапа начинает эксплуатировать чужие, хозяйские ферменты. Чтобы наработать другие компоненты вириона, необходимо переписать информацию, содержащуюся в ДНК, немного другим языком. Начинается транскрипция : по копиям ДНК синтезируются нити РНК - посредники, которые будут передавать (транслировать ) хранящиеся в ДНК инструкции клеточным машинам, производящим белок. Только на основе таких посредников могут строиться белки. Происходит это уже в цитоплазме и, конечно, на хозяйском оборудовании - рибосомах . То есть вирус вынуждает клетку работать только на него и жертвовать своими потребностями. Клетка страдает от дефицита собственных и наработки чужих веществ и даже может покончить с собой. Но и без того участь ее незавидна. Новые компоненты вирусного капсида связываются с новыми молекулами нуклеиновой кислоты - происходит самосборка вирионов, которые могут по-партизански отпочковаться от клетки, укутавшись ее мембраной, а могут выскочить в едином лихом порыве, и покалеченная клетка лопнет (лизируется ).
Самые предусмотрительные вирусы затаиваются «наглухо», пока не почувствуют, что настал подходящий момент для активного размножения. Таковы, например, герпесвирусы и некоторые бактериофаги. Некоторые из них так и не успевают пробудиться.
А вирусы вирусов вообще редко вредят своим «хозяевам». Да и хозяевами-то вирусы назвать сложно. Просто их фабриками по производству вирионов начинают без спроса пользоваться вирусы-приживалы. Правда, отдельные виды - вирофаги - могут способствовать выживанию клеток, страдающих от этих самых «хозяев» .
Все ли вирусы - злодеи?
От вирусов страдает не только человек, но и животные, и растения. Однако такие сложные живые организмы сталкивались с вирусами уже с момента своего возникновения и потому приспособились к совместному сосуществованию с большинством из них. Да и вирусу, как правило, незачем убивать хозяев - тогда ведь придется всё время искать новых, и если в скученных бактериальных сообществах это не так уж и сложно, то вот в человеческих...
С большинством вирусов прекрасно справляются защитные системы нашего организма, поэтому для лечения нетяжелых кишечных расстройств и «простуд», вызываемых разнообразными агентами, ничего особенного даже и изобретать не стали. Пока ищешь истинного виновника, человек уже выздоравливает. Более того, вирусы могут быть и нашими союзниками: на примере вирусов биологи изучают разные молекулярные процессы, их же используют для генной инженерии; в то же время бактериофаги умеют расправляться с болезнетворными бактериями , а некоторые «спящие» герпесвирусы, возможно, способны защищать от заражения... чумой.
Но если отвлечься от добрых и злых, с точки зрения человека, дел вирусов, то нужно признать, что на этих невидимках во многом держится наш мир: они переносят свои и чужие гены от организма к организму, увеличивая генетическое разнообразие, регулируют численность сообществ живых существ и просто необходимы для круговорота биогенных элементов , ведь вирусы - самые многочисленные биообъекты на нашей планете.
Первооткрыватель вирусов Д. И. Ивановский выявил два их основных свойства они столь малы, что проходят через фильтры, задерживающие бактерии, и их невозможно, в отличие от клеток, выращивать на искусственных питательных средах. Лишь с помощью электронного микроскопа удалось увидеть эти мельчайшие из живых существ и оценить многообразие их форм.
Ни один из известных вирусов не способен к самостоятельному существованию. Вирусы могут существовать в двух формах: внеклеточной и внутриклеточной. Вне клеток вирионы (вирусные частицы) не обнаруживают признаков жизни. Попав в организм, они проникают в чувствительные к ним клетки и переходят из покоящейся формы в размножающуюся.
Начинается сложное и многообразное взаимодействие вирусов и клетки, заканчивающееся образованием и выходом в окружающую среду дочерних вирионов.
В зависимости от длительности пребывания вируса в клетке и характера изменения её функционирования различают три типа вирусной инфекции. Если образующиеся вирусы одновременно покидают клетку, то она разрывается и гибнет. Вышедшие из неё вирусы поражают новые клетки. Так развивается литическая(разрушение, растворение) инфекция. При вирусной инфекции другого типа, называемой персистентной(стойкой) , новые вирусы покидают клетку хозяина постепенно. Клетка продолжает жить и делится, производя новые вирусы, хотя её функционирование может измениться.
Третий тип инфекции называется латентным(скрытым). Генетический материал вируса встраивается в хромосомы клетки и при её делении воспроизводится и передаётся дочерними клетками. При определённых условиях в некоторых из заражённых клеток латентный вирус активируется, размножается, и его потомки покидают клетки. Инфекция развивается по литическому или персистентному типу. Болезни, которые вызываются вирусами, легко передаются от больных здоровым и быстро распространяются. Долгое время полагали, что вирусы вызывают острые массовые заболевания. К настоящему времени накоплено много доказательств того, что вирусы являются причиной и различных хронических болезней длящихся годами и даже десятилетиями. Разработка методов изучения вирусов, открытие вирусов (теперь их известно около полутора тысяч), определение диапазона их болезнетворных проявлений и попытки борьбы с ними были основным содержанием вирусологии первый половины нашего столетия. Именно негативные свойства вирусов, точнее способность вызывать болезни, послужили вначале главным стимулом к их изучению. Но в процессе этой работы были обнаружены многие положительные свойства вирусов,благодаря которым во второй половине 20 в. они стали замечательной моделью для исследования фундаментальных проблем биологии. С их помощью были сделаны такие выдающиеся открытия, как расшифровка генетического кода и строение генетических нуклеиновых кислот, установлены закономерности синтеза белков. Вирусы оказались основным инструментом генетической инженерии. Теперь мы знаем что по своему строению и свойствам вирусы занимают промежуточное место между сложнейшими химическими веществами (полимерами, макромолекулами) и простейшими организмами (бактериями).
1.1Строение и химический состав вирионов.
Самые крупные вирусы (вирусы оспы) приближаются по размерам к небольшим размерам бактерий, самые мелкие (возбудители энцефалита, полиомиелита, ящура)к крупным белковым молекулам, направленных к молекулам гемоглобина крови. Иными словами, среди вирусов есть свои великаны и карлики. Для измерения вирусов используют условную величину, называемую нанометром (я1нм). Один нм составляет миллионную долю миллиметра. Размеры разных вирусов варьируют от 20 до нескольких сотеня1 нм.
Простые вирусы состоят из белка и нуклеиновый кислоты. Наиболее важная часть вирусной частицы нуклеиновая кислота является носителем генетической информации. Если клетки человека, животных, растений и бактерий всегда содержат два типа нуклеиновых кислот дезоксирибонуклеиновую кислоту ДНК и рибонуклеиновую РНК, то у разных вирусов обнаружен лишь один тип или ДНК, или РНК, что положено в основу их классификации. Второй обязательный компонент вириона белки отличаются у разных вирусов, что позволяет распознавать их с помощью иммунологических реакций.
Более сложные по структуре вирусы, кроме белков и нуклеиновых кислот, содержат углеводы, липиды. Для каждой группы вирусов характерен свой набор белков, жиров, углеводов и нуклеиновых кислот. Некоторые вирусы содержат в своём составе ферменты. Каждый компонент вирионов имеет определённые функции: белковая оболочка защищает их от неблагоприятных воздействий, нуклеиновая кислота отвечает за наследственные и инфекционные свойства и играет ведущую роль в изменчивости вирусов, а ферменты участвуют в их размножении. Обычно нуклеиновая кислота находится в центре вириона и окружена белковой оболочкой (капсидом), как бы одета в неё.
Капсид состоит из определённым образом уложенных однотипных белковых молекул (капсомеров), которые образуют симметричные геометрические формы в месте с нуклеиновой кислотой вирусы (нуклеокапсид). В случае кубической симметрии нуклеокапсида нить нуклеиновой кислоты свёрнута в клубок, а капсомеры плотно уложены вокруг неё. Так устроены вирусы полиомиелита, ящура и др.
При спиральной (палочковидной) симметрии нуклеокапсида нить вируса закручена в виде спирали, каждый её виток покрыт капсомерами, темно прилегающими друг к другу. Структуру капсомеров и внешний вид вирионов можно наблюдать с помощью электронной микроскопии.
Большая часть вирусов, вызывающих инфекции у человека и животных, имеет кубический тип симметрии. Капсид почти всегда имеет форму икосаэдра правильного двадцатигранника с двенадцатью вершинами и с гранями из равносторонних треугольников.
Многие вирусы помимо белкового капсида имеют внешнюю оболочку. Кроме вирусных белков и гликопротеинов она содержит ещё и липиды, позаимствованные у плазматической мембраны клетки хозяина. Вирус гриппа пример спирального вириона в оболочке с кубическим типом симметрии.
Современная классификация вирусов основана на виде и формы их нуклеиновой кислоты, типе симметрии и наличии или отсутствие внешней оболочки.
1.2Размножение вирусов.
Размножение вирусов происходит особым, ни с чем не сравнимым способом. Сначала вирионы проникают внутрь клетки, и освобождаются вирусные нуклеиновые кислоты. Затем "заготавливаются" детали будущих вирионов. Размножение заканчивается сборкой новых вирионов и выходом их в окружающую среду.
Рассмотрим простейший способ размножения вирусов. Представим себе некий обобщённый вариант вирусной частицы, состоящей из двух основных компонентов нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), заключённой в белковой чехол (оболочку). Встреча вирусов с клетками начинается с его адсорбции, то есть прикрепления к клеточной стенки, плазматической мембране клетки. Причём каждый вирион способен прикрепляться лишь к определённым клеткам, имеющие специальные рецепторы. На одной клетке могут адсорбироваться десятки и даже сотни вирионов. Затем начинается внедрение или проникновение вириона в клетку, которое осуществляет она сама. Этот процесс называется виропексисом.
Клетка как бы "втягивает" прикрепившихся вирионов внутрь. Более просто устроены бактерии не способны сами захватывать вирионы из окружающей среды. Этим, по видимому, и можно объяснить наличие у поражающих их вирусов сложного и совершенного аппарата, подобно шприцу, впрыскивающего нуклеиновые кислоты.
В зараженной клетке бактериальные ферменты репликации синтезируют комплиментарную ей цепь, которая служит матрицей для образования фаговых ДНК. Они соединяются с фаговыми белками, также синтезированные бактериальными ферментами, и новые фаги покидают клетку хозяина.
Разнообразие видов и форм вирусов нуклеиновых кислот определяет и разнообразие способов их репликации. Бактериофаг (вирус, который поселяется в клетках бактерий) Т4 имеет одну двухцепочечную линейную молекулу, состоящую из 160x10 пар нуклеотидов. В ней закодировано более 150 различных белков, в том числе более 30 белков, участвующих в репликации фаговой ДНК. Обезьяний вирус SV40 имеет двухцепочечную кольцевую ДНК. Репликация у вирусов с двухцепочечной ДНК принципиально не отличается от репликации бактериальной и или эукариотической ДНК.
Многие вирусы растений содержат одну линейную молекулу РНК, например первый из описанных вирус табачной мозаики (ВТМ). Молекула РНК ВТМ заключена в белковый капсид, состоящий из 2130 идентичных полипептидных субъединиц.
Репликация РНК вируса табачной мозаики осуществляется ферментом, называемым РНК зависимой РНК полимеразой, закодированной в геноме вируса. Сначала этот фермент строит комплиментарную РНК, а затем по ней, как по матрице, синтезирует множество вирусных РНК.
Поразительно, как вирусы, которые в десятки и даже сотни раз меньше клеток, умело и уверенно распоряжаются клеточным хозяйством. Для построения себе подобных они используют клеточные материалы и энергию. Размножаясь, они истощают клеточные ресурсы и глубоко, часто необратимо, нарушают обмен веществ, что в конечном счёте является причиной гибели клеток.
Процесс репродукции вирусов условно можно разделить на 2 фазы. Первая фаза включает 3 стадии : 1) адсорбцию вируса на чувствительных клетках; 2) проникновение вируса в клетку; 3) депротеинизацию вируса. Вторая фаза включает стадии реализации вирусного генома : 1) транскрипцию, 2) трансляцию, 3) репликацию, 4) сборку, созревание вирусных частиц и 5) выход вируса из клетки.
Взаимодействие вируса с клеткой начинается с процесса адсорбции, т. е. с прикрепления вируса к поверхности клетки.
Адсорбция представляет собой специфическое связывание вирионного белка (антирецептора) с комплементарной структурой клеточной поверхности — клеточным рецептором. По химической природе рецепторы, на которых фиксируются вирусы, относятся к двум группам: мукопротеидным и липопротеидным. Вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы фиксируются на мукопротеидных рецепторах. Энтеровирусы, вирусы герпеса, арбовирусы адсорбируются на липопротеидных рецепторах клетки. Адсорбция происходит лишь при наличии определённых электролитов, в частности ионов Са2+, которые нейтрализуют избыточные анионные заряды вируса и клеточной поверхности и уменьшают электростатическое отталкивание Адсорбция вирусов мало зависит от температуры Начальные процессы адсорбции носят неспецифический характер, являются результатом электростатического взаимодействия положительно и отрицательно заряженных структур на поверхности вируса и клетки, а затем наступает специфическое взаимодействие прикрепительного белка вириона со специфическими группировками на плазматической мембране клетки. Простые вирусы человека и животных содержат прикрепительные белки в составе капсида. У сложно организованных вирусов прикрепительные белки входят в состав супер-капсида. Они могут иметь форму нитей (фибры у аденовирусов), либо шипов, грибоподобных структур у миксо-, ретро-, рабдо- и других вирусов. Вначале происходит единичная связь вириона с рецептором — такое прикрепление непрочное — адсорбция носит обратимый характер. Чтобы наступила необратимая адсорбция, должы появиться множественные связи между рецептором вируса и рецептором клетки, т. е. стабильное мультивалентное прикрепление. Количество специфических рецепторов на поверхности одной клетки составляет 10 4 -10 5 . Рецепторы для некоторых вирусов, например, для арбовирусов. содержатся на клетках как позвоночных, так и беспозвоночных, для других вирусов только на клетках одного или нескольких видов.
Проникновение вирусов человека и животных в клетку происходит двумя путями: 1) виропексисом (пиноцитозом); 2) слиянием вирусной суперкапсидной оболочки е клеточной мембраной. Бактериофаги имеют свой механизм проникновения, так называемый шприцевои, когда в результате сокращения белкового отростка фага нуклеиновая кислота как бы впрыскивается в клетку.
Депротеинизация вируса освобождение геиома вируса от вирусных защитных оболочек происходит либо с помощью вирусных ферментов, либо с помощью клеточных ферментов. Конечными продуктами депротеинизации являются нуклеиновые кислоты или нуклеиновые кислоты, связанные с внутренним вирусным белком. Затем имеет место вторая фаза вирусной репродукции, ведущая к синтезу вирусных компонентов.
Транскрипция — переписывание информации с ДНК или РНК вируса на и-РНК по законам генетического кода.
Трансляция — процесс перевода генетической информации, содержащейся в и-РНК, на специфическую последовательность аминокислот.
Репликация — процесс синтеза молекул нуклеиновых кислот, гомологичных вирусному геному.
Реализация генетической информации у ДНК-содержащих вирусов идёт так же, как и в клетках:
ДНК транскрипция и-РНК трансляция белок
РНК транскрипция и-РНК трансляция белок
У вирусов с позитивным РНК-геномом (тогавирусы, пикорнавирусы) транскрипция отсутствует:
РНК трансляция белок
У ретровирусов — уникальный путь передачи генетической информации:
РНК обратная транскрипция ДНК транскрипция и-РНК трансляция белок
ДНК интегрируется с геномом клетки-хозяина (провирус).
После наработки клеткой вирусных компонентов наступает последняя стадия вирусной репродукции сборка вирусных частиц и выход вирионов из клетки. Выход вирионов из клетки осуществляется двумя путями: 1) путём «взрыва» клетки, в результате чего клетка разрушается. Этот путь присущ простым вирусам (пикорна-, рео-, папова- и аденовирусам), 2) выход из клеток путём почкования. Присущ вирусам, содержащим суперкапсид. При этом способе клетка сразу не погибает, может дать многократное вирусное потомство, пока не истощатся её ресурсы.
Методы культивирования вирусов
Для культивирования вирусов в лабораторных условиях используются ледуюшие живые объекты: 1) культуры клеток (тканей, органов); 2) куриные мбрионы; 3) лабораторные животные.
Культуры клеток
Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить на 1) первичные (первично трипсинизированные), 2) полуперевиваемые (диплоидные) и 3) перевиваемые.
По происхождению они классифицируются на эмбрионштьные, опухолевые и из взрослых организмов; по морфогенезу — на фибробластные, эпителиальные и др.
Первичные культуры клеток — это клетки какой-либо ткани человека или животного, которые имеют способность расти в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности, покрытой специальной питательной средой. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получают из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.
Полуперевиваемые (или диплоидные ) культуры клеток — клетки одного типа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин.
Перевиваемые клеточные линии характеризуются потенциальным бессмертием и гетероплоидным кариотипом.
Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные культуры (например, СОЦ, ПЭС, ВНК-21 — из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС — из почки морской свинки и др.) отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению из клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформированными.
Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Наиболее часто в вирусологической практике применяются такие линии перевиваемых клеток: HeLa — получена из карциномы шейки матки; Нер-2 — из карциномы гортани; Детройт-6 — из метастаза рака лёгкого в костный мозг; RH — из почки человека.
Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых питательных сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.
Широкое применение находят стандартные синтетические среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред — сыворотка крови животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5-10% которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит.
Выделение вирусов в культурах клеток и методы их индикации.
При выделении вирусов из различных инфекционных материалов от больного (кровь, моча, фекалии, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток, обладающие наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл взвеси испытуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения бактерий и грибов. После 30-60 мин. контакта вируса с клетками удаляют избыток материала, вносят в пробирку поддерживающую среду и оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.
Индикатором наличия вируса в заражённых культурах клеток может служить:
1) развитие специфической дегенерации клеток — цитопатическое действие вируса (ЦПД), которое имеет три основных типа: кругло- или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских клеток — симпластов; развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток;
2) обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и ядрах пораженных клеток;
3) положительная реакция гамагтлютинации (РГА);
4) положительная реакция гемадсорбции (РГАдс);
5) феномен бляшкообразования: монослой зараженных вирусом клеток покрывается тонким слоем агара с добавлением индикатора нейтрального красного (фон — розовый). При наличии вируса в клетках образуются бесцветные зоны («бляшки») на розовом фоне агара.
6) при отсутствии ЦПД или ГА можно поставить реакцию интерференции: исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительная). Если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.
Выделение вирусов в куриных эмбрионах.
Для вирусологических исследований используют куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста.
Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона. При овоско-пировании живые эмбрионы подвижны, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом отмечают границы воздушного мешка. Заражают куриные эмбрионы в асептических условиях, стерильными инструментами, предварительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом и спиртом.
Методы заражения куриных эмбрионов могут быть различны: нанесение вируса на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую и аллантоисную полости, в желточный мешок. Выбор метода заражения зависит от биологических свойств изучаемого вируса.
Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по фокусным поражениям («бляшкам») на хорион-аллантоисной оболочке.
III. Выделение вирусов на лабораторных животных.
Лабораторные животные могут быть использованы для выделения вирусов из инфекционного материала, когда невозможно применить более удобные системы (культуры клеток или куриные эмбрионы). Берут преимущественно новорождённых белых мышей, хомяков, морских свинок, крысят. Заражают животных по принципу цитотропизма вируса: пневмотропные вирусы вводятся интраназально, нейротропные — интрацеребрально, дерматотропные — на кожу.
Индикация вируса основана на появлении признаков заболевания у животных, их гибели, патоморфологических и патогистологических изменений в тканях и органах, а также по положительной реакции гемагглтотинации с экстрактами из органов.
Вирионы представляют собой инертные формы, которые сами по себе не размножаются, а лишь существуют для передачи от одного организма другому и для перехода из одной клетки хозяина в другую и сохранения во внешней среде. В последнем случае они как бы напоминают роль споровых форм микроорганизмов.
Размножение вирусов является результатом репликации их генома и репродукции других структурных компонентов вириона. Эти процессы происходят внутри инфицированной клетки. Для того, чтобы вирус мог размножиться, он должен вначале заразить клетку; чтобы заразить клетку, вирус должен связаться с клеточной поверхностью, проникнуть в клетку и «раздеться» до такой степени, чтобы его геном стал способен реализовать свои генетические функции, в результате чего появится новое потомство вируса. Спектр хозяев разных вирусов значительно варьирует, он определяется как видами животных, так и типами клеток, в которых данный вирус может размножаться.
Одни вирусы имеют широкий спектр хозяев, другие заражают лишь клетки одного типа определенных видов животных. Способность клеток и организма заражаться вирусом называют, соответственно, чувствительностью и восприимчивостью. Когда восприимчивый организм вступает в контакт с вирусом, первоначально заражаются лишь чувствительные клетки у входных ворот инфекции (например, миндалины). Однако для клинического проявления инфекции этого может оказаться недостаточно, так как болезнь возникает вследствие заражения клеток-мишеней (например, нейронов, гепатоцитов) после того, как вирус размножился на месте внедрения в организм. В ряде случаев клетки-мишени располагаются у входных ворот инфекции (например, кишечные, респираторные инфекции).
События, происходящие в инфицированной клетке, могут существенно различаться и конечный результат их также может быть различным - от размножения вируса (продуктивная инфекция) с разрушением или/без разрушения клеток до трансформации клеток, которые приобретают способность к неограниченному делению.
Многие цитопатогенные вирусы обладают способностью к установлению персистентной инфекции в чувствительных клетках. Молекулярные механизмы персистенции вирусов в клеточных культурах окончательно не выяснены.
Репликация вирусов занимает центральное место в молекулярной биологии. Основные закономерности репликации вирусов первоначально были изучены в опытах с бактериофагами, а с появлением культур клеток млекопитающих эти методы были адаптированы к вирусам животных.
В начале инфекций в клетку проникает вирусный геном (РН К или ДНК), часто вместе с необходимыми вирионными белками. Несмотря на существенные различия в стратегии размножения разных семейств ДНК- и РНК-вирусов, особенно в отношении транскрипции и репликации их геномов, этот процесс имеет общие характерные особенности, свойственные всем вирусам. Главная из них состоит в том, что способность вирусов к размножению и судьба зараженных клеток зависят от синтеза и функции продуктов вирусных генов - белков, которые обеспечивают: а) репликацию вирусного генома и синтез вирусных белков, б) упаковку генома в вирусные частицы (вирионы) и в) изменение структуры и (или) функции зараженных клеток.
Стратегия, применяемая вирусами для обеспечения этих функций, варьирует. Иногда вирусные белки (папиллома и полиомавирусы) просто помогают ферментам клетки хозяина реплицировать вирусный геном. В большинстве случаев вирусные белки сами обеспечивают репликацию вирусного генома, но даже наиболее независимые вирусы, как правило, используют при этом по крайней мере несколько белков хозяина.